Imagerie par bioluminescence pour l’étude des transitoires calciques dans les structures cérébrales de la drosophile

Résumé

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p style='line-height :1.38 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Source : Lark, A. R., et. al., approche d’imagerie cérébrale fonctionnelle in vivo basée sur l’indicateur de calcium bioluminescent GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’imagerie en temps réel de la dynamique calcique à l’aide de la bioluminescence de la protéine fluorescente verte-aequorin dans Drosophila’s structures cérébrales profondes.

Protocole

1. Imaging

1. coup monté
   1. Démarrez le système d’enregistrement en allumant le microscope, l’ordinateur, l’appareil photo et le système de drainage et en réglant les contrôles environnementaux de la pièce à 25 °C.
   2. Ouvrez le programme Measurement and Automation Explorer sur l’ordinateur. Cliquez sur « Périphériques et interfaces », puis double-cliquez sur « NI Motion Devices, » et enfin faites un clic droit sur « PCI-7334 » et sélectionnez « initialiser le périphérique ».
   3. Ouvrez l’imageur de photons. Créez un nouveau dossier et nommez le premier fichier d’enregistrement. L’appareil photo doit atteindre -80 °C pour que le système fonctionne.
   4. Installez le système de perfusion : ajoutez du KCl (chlorure de potassium), de la nicotine et la solution de Ringer dans les réservoirs et ajustez pour que chaque solution se décharge à 2 ml/min. Lavez avec la solution de Ringer avant de commencer l’expérience.
2. Prepare sample
   1. Placez le bloc de monture d’imagerie sur la monture sous un microscope à un grossissement de 5X et insérez le tube de perfusion dans le canal par la ponction.
   2. Réglez le microscope en mode fluorescent, puis centrez et faites la mise au point sur les corps de champignon. Ajustez à 20X, recentrez et faites la mise au point.
   3. Placez l’appareil de drainage au-dessus de la piscine de drainage, ajustez la hauteur de la dérivation de drainage de sorte que la pointe soit juste au-dessus de la piscine et faites fonctionner la solution de Ringer pendant 30 secondes pour assurer un drainage adéquat.
   4. Tirez le bouclier vers le bas pour isoler l’appareil de la lumière. À l’aide du système automatisé de l’imageur de photons, effectuez des réglages précis de la mise au point et prenez une image fluorescente de référence des MB.
3. Enregistrement
   1. Ajustez la vitesse des photons à la vitesse d’enregistrement souhaitée (de 50 ms à 1 sec ou plus). Sélectionnez le mode photon et ouvrez l’obturateur. Consignez le génotype, le sexe, l’âge et le numéro de l’échantillon dans les entrées du registre. Ajustez la position des cases ROI (Région d’intérêt) sur le calice et les corps cellulaires (CCB) et les lobes médiaux en cliquant sur les zones ROI et en les faisant glisser tout en maintenant le contrôle enfoncé.
   2. Enregistrez la ligne de base pendant environ 5 à 10 minutes (si vous le souhaitez).
   3. Appliquez de la nicotine pendant 1 min. Notez start/stop dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 5 min.
   4. Attendez 5 min pour la récupération et préparez l’entrée de journal KCl (chlorure de potassium) et la minuterie.
   5. Appliquer le KCl pendant 1 min. Notez start/stop dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 1 min.
   6. Passez en mode fluorescent, prenez l’image fluorescente finale et désactivez la solution de Sonnerie.
   7. Appuyez sur « Stop ». Une boîte de dialogue vous demandera si vous souhaitez éteindre le système. Sélectionnez « Non » pour continuer l’enregistrement.
   8. Ouvrez le bouclier, déplacez le système de drainage, mettez l’objectif de l’objectif à 5X et retirez le tube de perfusion. Retirez l’échantillon/le plat d’enregistrement de la scène et nettoyez l’objectif 20X en rinçant et en essuyant l’objectif deux fois à l’eau.
   9. Appuyez sur le bouton de lecture blanc en haut de la fenêtre du programme pour lancer l’enregistrement suivant.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich style='overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;white-space :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>S3014
Chlorure de calcium	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich style='débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;espace-blanc :normal ;habillage de mots :pause-mot ;stratégie-d’habillage :4 ;'>7365-45-9
Chlorure de potassium	Prolabo	26 764.298
Chlorure de magnésium	Prolabo	25 108.295
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adénosine 5′-triphosphate disodium sel hydrate
Benzyl-coelentrazine	Prolume, nanolight	cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/<
pointes de pipette	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal pipette tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (refroidi à -80°C)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Objectif d’immersion	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
microscope de dissection avec fluorescence	Leica MZ Fl III	N/A	Leica Dissection scope and Fleescent Lamp<
Pompe péristaltique	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	Dépend de l’épaisseur	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Système de contrôle de soupape de perfusion, complet, avec soupapes à manchon, 6 canaux
Régulateurs de perfusion	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Exploration de mesures et d’automatisation	Sciences Wares & National Instruments	N/A	logiciel http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	logiciel http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	logiciel http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	logiciel https://www.microsoft.com
Doublage virtuel	accès ouvert	N/A	logiciel http://virtualdub.sourceforge.net/

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